O que sai do sequenciador · parte 1 de 4 14 min de leitura

🗂️ Os arquivos do RNA-Seq: FASTQ, FASTA, GTF, BAM e a matriz de contagens¶

Toda análise de RNA-Seq é uma sequência de conversões de arquivo. Saber o que cada um guarda é o que permite entender, e depurar, qualquer pipeline.

Para quem tem pressa

O sequenciador entrega FASTQ: milhões de leituras curtas, cada uma com a qualidade de cada base. Para dar sentido a elas, usamos duas referências públicas: o genoma em FASTA (a sequência) e a anotação em GTF (onde estão os genes). O alinhador posiciona cada leitura no genoma e grava o resultado em SAM/BAM. Por fim, contamos quantas leituras caíram em cada gene e chegamos à matriz de contagens (genes × amostras), que é a entrada da análise estatística com ferramentas como o DESeq2.

Este é o primeiro post do ciclo "O que sai do sequenciador". Os próximos mostram como abrir esses arquivos no terminal Linux, como inspecionar um FASTQ real e por que a qualidade é escrita com símbolos.

O caminho dos dados¶

Sala de sequenciamento com vários sequenciadores Illumina HiSeq 2000 lado a lado — Sequenciadores Illumina HiSeq 2000 no BGI, em Hong Kong. Cada equipamento desses produz arquivos FASTQ com centenas de milhões de leituras. Foto: Scotted400, Wikimedia Commons, CC BY 3.0.

Num experimento de RNA-Seq, o RNA extraído vira uma biblioteca de cDNA, que é sequenciada (veja RNA-Seq bulk). A partir daí, tudo é dado: cada etapa do pipeline lê um formato de arquivo e escreve outro.

flowchart LR
    S[Sequenciador] --> FQ[FASTQ<br/>leituras + qualidade]
    FA[FASTA<br/>genoma de referência] -.-> AL((alinhamento))
    FQ --> AL
    AL --> BAM[BAM<br/>leituras posicionadas]
    GTF[GTF<br/>anotação dos genes] -.-> CT((contagem))
    BAM --> CT
    CT --> M[Matriz de contagens<br/>genes × amostras]
    M --> DE[Expressão diferencial<br/>DESeq2]

As linhas contínuas são os seus dados, que mudam de formato a cada etapa. As tracejadas são referências públicas, baixadas de bancos como o Ensembl ou o GENCODE, que precisam ser da mesma versão entre si.

O erro mais comum de iniciante

Usar um genoma FASTA de uma versão (por exemplo, GRCh38) com um GTF de outra (GRCh37/hg19). As coordenadas não batem, e o resultado sai errado sem nenhuma mensagem de erro. Baixe sempre o FASTA e o GTF do mesmo lançamento.

FASTQ: leituras e qualidade¶

O FASTQ é o arquivo que sai do sequenciador. Ele guarda cada leitura (read) e, junto dela, a confiança do equipamento em cada base lida¹. Cada leitura ocupa exatamente quatro linhas:

@A00123:8:H5KJ2DSXY:1:1101:10004:1000 1:N:0:ATCACG
CATTGCTGATCCACAGTTTAGCGA
+
IIIIIHHHGGGFF@@@>>;;88##

Identificador, começando com @. Nos equipamentos Illumina atuais, ele codifica o instrumento, a corrida, a flow cell, a posição do cluster e o número da leitura (1 ou 2).
Sequência das bases: A, C, G, T ou N (base não identificada).
Separador +, às vezes seguido de uma cópia do identificador.
Qualidade: um caractere para cada base da linha 2.

Como ler a linha de qualidade¶

Cada caractere representa um escore Phred (Q), definido pela probabilidade P de a base estar errada²:

Q = −10 × log₁₀(P)

Q10 significa 1 erro em 10, Q20 significa 1 em 100 e Q30, 1 em 1.000. Para caber em um único caractere, o valor é somado a 33 e gravado como o símbolo ASCII correspondente (codificação Phred+33). Assim, I (ASCII 73) vale Q40, e # (ASCII 35) vale Q2.

Clique em qualquer base abaixo para decodificar a qualidade:

Por que +33?

Os primeiros 32 códigos da tabela ASCII são caracteres invisíveis (quebra de linha, tabulação etc.), e o 32 é o espaço. Começar no 33 (!) garante que todo escore vire um símbolo imprimível. Equipamentos Illumina antigos (versões 1.3 a 1.7 do pipeline) usavam Phred+64: se um FASTQ antigo parecer ter qualidades absurdas, essa é a primeira suspeita¹.

Slide do carrossel MW Explica explicando as quatro linhas do FASTQ — As quatro linhas do FASTQ no carrossel do Instagram.

R1, R2 e .gz¶

Paired-end: quando os dois lados de cada fragmento são sequenciados, cada amostra tem dois arquivos, _R1.fastq.gz e _R2.fastq.gz. A leitura de número n do R1 é o par da leitura n do R2, por isso os dois arquivos nunca devem ser ordenados ou filtrados separadamente.
Compressão: FASTQ quase sempre vem comprimido com gzip (.fastq.gz ou .fq.gz). As ferramentas de bioinformática leem o arquivo comprimido diretamente, então não é preciso descompactar.

FASTA: a sequência de referência¶

O formato FASTA nasceu com o programa de mesmo nome, de busca por similaridade de sequências³. Ele é o formato mais simples possível: uma linha de cabeçalho começando com > e, abaixo, a sequência.

>chrM
GATCACAGGTCTATCACCCTATTAACCACTCACGGGAGCTCTCCATGCATTTGGTATT

Este é o início real do DNA mitocondrial humano, na sequência de referência revisada de Cambridge (rCRS)⁴, que também faz parte do genoma de referência GRCh38.

Flow cell do sequenciador Illumina NextSeq — Flow cell de um Illumina NextSeq: é na superfície de vidro dela que os fragmentos de DNA são lidos. O que sai daí é FASTQ; o FASTA é a referência contra a qual comparamos. Foto: Cirosantilli2, Wikimedia Commons, CC BY-SA 4.0.

	FASTQ	FASTA
Começa com	`@`	`>`
Linhas por registro	sempre 4	1 de cabeçalho + quantas forem precisas
Tem qualidade?	sim, uma por base	não
De onde vem	do seu sequenciamento	de bancos públicos (Ensembl, GENCODE, NCBI)
Tamanho típico de cada sequência	50 a 300 bases (Illumina)	de um gene a um cromossomo inteiro

Um mesmo arquivo pode conter várias sequências (multi-FASTA): o genoma humano inteiro é um único FASTA com um registro por cromossomo. Para acessar um trecho rapidamente sem ler o arquivo todo, as ferramentas criam um índice .fai (com samtools faidx)⁹.

Genoma ou transcriptoma?

Alinhadores como o STAR usam o genoma em FASTA. Ferramentas de pseudo-alinhamento, como o Salmon, usam o transcriptoma: um FASTA com a sequência de cada transcrito já processado (sem íntrons). Os dois são baixados dos mesmos bancos.

Já mostramos como baixar um FASTA do NCBI no carrossel MW na Prática #001.

GTF: o mapa dos genes¶

O FASTA diz qual é a sequência do genoma, mas não diz onde estão os genes. Essa informação vem da anotação, distribuída em GTF (Gene Transfer Format) ou no formato irmão GFF3⁵⁶. Cada linha descreve um elemento (gene, transcrito, éxon, CDS…) em 9 colunas separadas por tabulação:

#	Coluna	Exemplo (TP53)	Significado
1	seqname	`chr17`	cromossomo
2	source	`HAVANA`	quem anotou
3	feature	`gene`	tipo do elemento
4	start	`7661779`	início
5	end	`7687538`	fim
6	score	`.`	não usado na anotação de genes
7	strand	`-`	fita (+ ou −)
8	frame	`.`	fase de leitura (só para CDS)
9	attributes	`gene_id "ENSG00000141510"; gene_name "TP53";`	identificadores e nomes

O TP53, o mesmo gene do nosso carrossel sobre o NCBI, fica na fita − do cromossomo 17. Isso significa que ele é lido "de trás para frente" em relação à numeração do cromossomo.

Coordenadas: GTF começa em 1, BED começa em 0

No GTF, a primeira base do cromossomo é a posição 1, e o intervalo inclui o início e o fim. No formato BED, outro muito usado, a contagem começa em 0 e o fim não é incluído. Converter entre os dois sem ajustar gera erros de uma base, difíceis de perceber.

GTFGFF3

chr17  HAVANA  gene  7661779  7687538  .  -  .  gene_id "ENSG00000141510"; gene_name "TP53";

chr17  HAVANA  gene  7661779  7687538  .  -  .  ID=ENSG00000141510;gene_name=TP53

A diferença está só na última coluna: o GTF usa chave "valor"; e o GFF3 usa chave=valor, com relações de parentesco explícitas (Parent=) entre gene, transcrito e éxon.

SAM e BAM: cada leitura no seu lugar¶

O alinhador (STAR, HISAT2, BWA…) pega cada leitura do FASTQ, procura de onde ela veio no genoma FASTA e escreve o resultado em SAM (Sequence Alignment/Map)⁷. O SAM é texto puro, com um cabeçalho (linhas começando com @) e uma linha por alinhamento, com 11 colunas obrigatórias:

#	Campo	O que guarda
1	QNAME	nome da leitura (o mesmo do FASTQ)
2	FLAG	um número que resume o estado da leitura (veja o decodificador abaixo)
3	RNAME	cromossomo onde ela alinhou
4	POS	posição da primeira base alinhada (começa em 1)
5	MAPQ	confiança de que a posição está certa, em escala Phred
6	CIGAR	como a leitura alinhou: bases iguais, inserções, deleções, íntrons
7–9	RNEXT, PNEXT, TLEN	onde está o par (em paired-end) e o tamanho do fragmento
10	SEQ	a sequência da leitura
11	QUAL	a qualidade, igual à do FASTQ

O BAM é o mesmo conteúdo, comprimido em formato binário. Ele é bem menor que o SAM e, depois de ordenado por posição e indexado (arquivo .bai), permite ir direto a qualquer região do genoma. É assim que visualizadores como o IGV mostram as leituras de um gene instantaneamente⁸. Na prática, quase ninguém guarda SAM: o samtools converte, ordena e indexa⁹.

Slide do carrossel mostrando leituras empilhadas sobre a referência — Leituras alinhadas, uma diferença em relação à referência e uma leitura dividida por splicing.

A FLAG: muita informação num número só¶

A FLAG soma potências de 2. Cada uma é uma pergunta de sim ou não sobre a leitura. Marque as caixas, ou digite um valor, para ver a soma:

Os valores 99 e 147 são os mais comuns num BAM de paired-end: R1 e R2 de um mesmo par, ambos bem alinhados, um em cada fita.

O CIGAR: como a leitura se encaixou¶

O CIGAR descreve o alinhamento como uma sequência de número + letra. 50M significa 50 bases alinhadas. No RNA-Seq, a letra mais importante é o N: um salto no genoma sem bases da leitura, ou seja, um íntron que o splicing removeu. É assim que uma leitura de mRNA maduro aparece "partida" em dois éxons distantes.

E o CRAM?

Projetos grandes usam cada vez mais o CRAM, que comprime ainda mais guardando só as diferenças em relação ao genoma de referência¹⁰. A contrapartida: para abrir um CRAM, é preciso ter exatamente o mesmo FASTA usado para criá-lo.

A matriz de contagens¶

O último passo antes da estatística é contar. Para cada amostra, uma ferramenta percorre o BAM e, usando as coordenadas do GTF, decide a qual gene pertence cada leitura. O resultado é uma tabela com uma linha por gene e uma coluna por amostra:

gene	ctrl_1	ctrl_2	trat_1	trat_2
TP53	812	790	1.640	1.702
GAPDH	15.230	14.987	15.102	15.511
MYC	402	388	96	110
BRCA1	230	251	244	236

Valores ilustrativos.

Há três caminhos comuns para chegar a ela:

featureCounts / HTSeqSTAR --quantMode GeneCountsSalmon + tximport

Contam as leituras de um BAM que caem nos éxons de cada gene do GTF¹¹¹². São os métodos clássicos depois de um alinhador como o STAR ou o HISAT2.

O próprio STAR conta as leituras por gene enquanto alinha e grava um arquivo ReadsPerGene.out.tab por amostra¹³. Basta juntar as colunas de todas as amostras.

O Salmon pula o BAM e estima a abundância de cada transcrito direto do FASTQ. O pacote tximport soma os transcritos por gene e entrega uma matriz pronta para o DESeq2¹⁴.

Contagens brutas, não normalizadas

O DESeq2 espera contagens brutas: números inteiros, exatamente como saíram da contagem. Ele faz a própria normalização internamente¹⁵. Dar a ele valores já normalizados (TPM, FPKM, CPM) quebra o modelo estatístico. Os próximos ciclos do MW Explica vão explicar o porquê.

Tabela-resumo¶

Arquivo	Extensões	Guarda	Etapa	Como espiar
FASTQ	`.fastq.gz`, `.fq.gz`	leituras + qualidade	sai do sequenciador	`zcat arquivo.fastq.gz \\| head -8`
FASTA	`.fa`, `.fasta`, `.fna`	sequência de referência	referência do alinhamento	`head arquivo.fa`
GTF/GFF3	`.gtf`, `.gff3`	posição dos genes	referência da contagem	`grep -v "^#" anotacao.gtf \\| head`
SAM/BAM	`.sam`, `.bam` (+ `.bai`)	leituras alinhadas	sai do alinhador	`samtools view arquivo.bam \\| head`
Matriz	`.tsv`, `.csv`, `.txt`	contagens gene × amostra	entrada do DESeq2	`head contagens.tsv`

Os comandos dessa última coluna são o assunto do próximo post, no MW Toolbox.

Teste seus conhecimentos¶

1. Quantas linhas ocupa cada leitura em um FASTQ, e o que cada uma guarda?

Quatro: o identificador (começa com @), a sequência, o separador + e a qualidade, com um símbolo por base.

2. Uma base tem o símbolo 5 na linha de qualidade. Qual é o escore Phred dela?

O caractere 5 tem código ASCII 53. Em Phred+33, Q = 53 − 33 = 20, ou seja, 1 chance em 100 de estar errada.

3. Por que não dá para usar o FASTA do GRCh38 com o GTF do GRCh37?

Porque as coordenadas dos genes mudam entre as versões do genoma. As leituras seriam contadas nos genes errados, sem nenhuma mensagem de erro.

4. O que significa a letra N no CIGAR, e por que ela é tão comum em RNA-Seq?

N é um salto no genoma que não consome bases da leitura: um íntron. Como o RNA maduro já não tem íntrons, uma leitura que atravessa a junção entre dois éxons aparece dividida no genoma.

5. Por que o DESeq2 precisa de contagens brutas, e não de TPM?

Porque o modelo estatístico dele (binomial negativa) assume números inteiros de leituras e calcula a própria normalização. Valores já normalizados perdem a informação sobre a profundidade de cada amostra, da qual a estimativa de variância depende.

Referências¶

Cock PJA, Fields CJ, Goto N, Heuer ML, Rice PM. The Sanger FASTQ file format for sequences with quality scores, and the Solexa/Illumina FASTQ variants. Nucleic Acids Research. 2010;38(6):1767–1771. doi: 10.1093/nar/gkp1137. ↩↩
Ewing B, Green P. Base-calling of automated sequencer traces using Phred. II. Error probabilities. Genome Research. 1998;8(3):186–194. doi: 10.1101/gr.8.3.186. ↩
Pearson WR, Lipman DJ. Improved tools for biological sequence comparison. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1988;85(8):2444–2448. doi: 10.1073/pnas.85.8.2444. ↩
Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PF, Lightowlers RN, Turnbull DM, Howell N. Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA. Nature Genetics. 1999;23(2):147. doi: 10.1038/13779. ↩
Mudge JM, Carbonell-Sala S, Diekhans M, et al. GENCODE 2025: reference gene annotation for human and mouse. Nucleic Acids Research. 2025;53(D1):D966–D975. doi: 10.1093/nar/gkae1078. ↩
Ensembl. GFF/GTF file format. Documentação oficial: https://www.ensembl.org/info/website/upload/gff.html. ↩
Li H, Handsaker B, Wysoker A, et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 2009;25(16):2078–2079. doi: 10.1093/bioinformatics/btp352. Especificação atual: https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf. ↩
Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Winckler W, et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 2011;29(1):24–26. doi: 10.1038/nbt.1754. ↩
Danecek P, Bonfield JK, Liddle J, et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. GigaScience. 2021;10(2):giab008. doi: 10.1093/gigascience/giab008. ↩↩
Hsi-Yang Fritz M, Leinonen R, Cochrane G, Birney E. Efficient storage of high throughput DNA sequencing data using reference-based compression. Genome Research. 2011;21(5):734–740. doi: 10.1101/gr.114819.110. ↩
Liao Y, Smyth GK, Shi W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 2014;30(7):923–930. doi: 10.1093/bioinformatics/btt656. ↩
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Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 2014;15:550. doi: 10.1186/s13059-014-0550-8. ↩